膜蛋白表达成功率接近100%？无细胞系统破解膜蛋白“表达魔咒”

2025-12-02

一、膜蛋白：生命活动的“守门员”与药物研发的“黄金靶点”

蛋白质是细胞生命过程的重要执行者，而膜蛋白所扮演的角色让细胞得以成为生命的基本单元。从细菌到哺乳动物细胞，膜蛋白形成了众多高度保守的蛋白质家族，是生物膜功能的主要承担者，除了完成生物膜两侧的物质、能量和信息的传输，还担负着生物膜的合成、稳态维持等任务，并且参与细胞之间及膜被细胞器之间的相互作用[1] [2] 。正因为如此，膜蛋白与多种人类疾病密切相关，并且是直接的药物靶标。

图1:　典型β桶型膜蛋白E. coliOmp-F的晶体结构

然而，目前膜蛋白的研究仍然存在着较大差距：在人类基因组中，约然而，目前膜蛋白的研究仍然存在着较大差距：在人类基因组中，约30%的蛋白质基因参与编码膜蛋白（其余编码水溶性蛋白质）；但膜蛋白仅占蛋白质数据库（PDB）中沉积结构的约 3.6%（根据截至 2021 年 11 月的 PDBTM 数据库）。由此也可以看出膜蛋白的结构和功能研究拥有着广阔的发展空间。

二、结构决定功能：膜蛋白的核心类型

膜蛋白分为锚定蛋白和跨膜蛋白（又称为整合型膜蛋白），后者作为膜蛋白的核心亚型，对于所有生物体维持各种生物学功能至关重要，是物质跨膜转运、跨膜信号传递等关键过程的主要执行者。例如，离子通道、葡萄糖转运蛋白、G蛋白偶联受体等均为跨膜蛋白，其功能直接决定了细胞与外界环境的物质交换效率和信号响应能力，也是后续深入研究膜蛋白功能与应用的核心对象。

图2：膜蛋白分类

此外，具有天然构象的全长膜蛋白因其结构的特殊性和功能的不可替代性，使其成为连接细胞内外信号与生命活动的核心枢纽，为揭示 “跨膜区 - 胞内区 - 胞外区” 的相互调控机制提供关键依据，填补了截断体研究的局限性

三、跨越屏障：膜蛋白研究的三大挑战

由于膜蛋白的高度疏水性使其容易在水环境中聚集，因此研究膜蛋白通常具有挑战性，尤其是全长膜蛋白，获取其完整结构，一直是结构生物学领域的巨大挑战。

表达困难：当利用传统的细胞系统（如细菌、昆虫或哺乳动物细胞）来表达膜蛋白时，其疏水的跨膜区很容易被识别为“错误折叠”，导致蛋白聚集、形成包涵体，甚至对宿主细胞产生毒性，最终无法获得大量、正确折叠的蛋白。
提取与纯化困难：为了将膜蛋白“提取”出来进行研究，必须使用去垢剂来模拟其原生膜环境。这个过程非常苛刻，很容易破坏蛋白的天然结构，使其失去活性。提取出来的蛋白也不稳定，容易变性或聚集。
结构解析困难：经典的X射线晶体学需要获得高质量的三维晶体。但对于构象动态变化的全长膜蛋白来说，使其形成有序的晶体阵列极为困难。

这导致开发周期长、表达效率不稳定、普适性差。对于需要快速验证的大量候选蛋白，传统的细胞工厂无法进行与之匹配的高通量并行制造。因此，亟需一种新的蛋白合成方式来摆脱活细胞的局限性。

四、破局之道：无细胞表达系统如何“另辟蹊径”

无细胞蛋白质合成（CFPS）系统跳出了活细胞的限制，直接在体外利用细胞提取物合成目标蛋白，如同将细胞内的生命合成“生产线”搬到了“试管”中。合成体系开放，研究人员可自由调整离子强度、辅因子浓度；合成过程快速高效，且天然适配高通量操作，可在微孔板中并行合成与测试数十至上百个候选序列。此外，无细胞体系无生存压力，可通过外源添加去垢剂或纳米盘等成分，为膜蛋白提供类似天然膜环境的条件，有效维持其结构和功能。

【技术实践】：珀罗汀生物依托自主知识产权的无细胞蛋白表达技术，膜蛋白表达成功率接近100%。通过在表达的体系中加入去垢剂或纳米盘的方式保持膜蛋白的稳定性，使得膜蛋白更易表达纯化。我们成功表达过的膜蛋白包括细胞色素酶、呼吸链酶、ligand receptor等。

无细胞+去垢剂平台

通过在无细胞体系中直接添加去垢剂，可以为膜蛋白跨膜区提供疏水环境，辅助膜蛋白形成正确构象，实现全长跨膜蛋白可溶表达。

图3：跨膜蛋白表达。左图为七次跨膜蛋白；右图为四次跨膜蛋白。

无细胞+纳米盘平台

通过在无细胞体系中加入膜支架蛋白与磷脂，形成类似细胞膜的纳米盘结构，可以使合成的膜蛋白直接组装进纳米盘，高疏水性的跨膜区稳定插入脂双层，获得高稳定性、高活性、接近天然构象的全长膜蛋白。

图4：跨膜蛋白表达。左图为七次跨膜蛋白；右图为四次跨膜蛋白。

五、技术前景与展望

随着无细胞蛋白表达技术的成熟，其市场规模也在稳步增长。QYResearch调研显示，2023年全球无细胞蛋白表达市场销售额达到了15亿元，预计2030年将达到23亿元。这一增长背后是制药、生物技术领域对快速蛋白质开发工具的迫切需求。

人工智能与无细胞蛋白合成的结合，正在进一步加速这一领域的发展。AI已在蛋白质结构预测、序列生成与功能设计方面展现出强大威力，而无细胞体系则有潜力成为连接数字世界与物理实体的高效桥梁，将AI的海量设计方案快速转化为可测试的真实分子。将人工智能的设计能力与无细胞体系的快速合成能力相结合，被视为突破蛋白质工程瓶颈的关键。（详文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/LqhRvb6IWI4FXyuJxf6xpQ）

作为一项颠覆性技术，无细胞蛋白表达系统正在重塑膜蛋白研究的格局。从VLP平台、Nanodisc技术到我司的无细胞蛋白表达系统，这些创新工具使科学家能够在更贴近天然环境的条件下研究膜蛋白的结构与功能。随着人工智能与无细胞系统的深度融合，以及新方法的不断涌现，我们将有望揭开更多膜蛋白的神秘面纱，加速从基础研究到药物开发的转化进程，最终为人类疾病治疗带来新的突破。

参考资料：

膜蛋白结构动力学（第二版）；
Zhu, Jingyi, and Peilong Lu. “Computational design of transmembrane proteins.” Current opinion in structural biology vol. 74 (2022): 102381. doi:10.1016/j.sbi.2022.102381；
2024-2030年全球及中国无细胞蛋白表达行业运营动态及发展潜力研究报告。

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展会预告 | 共邀参加第十六届中国（泰州）国际医药博览会（简称：医博会）

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