用于治疗应用的外泌体、外泌体样纳米囊泡和工程化外泌体
2025-04-18
本期简介
来自韩国交通大学的研究人员在期刊《Journal of Controlled Release》上发表了一篇报道，名为“Hybrid exosomes, exosome-like nanovesicles and engineered exosomes for therapeutic applications”，该文章探讨了混合外泌体、类外泌体纳米囊泡和工程化外泌体在治疗应用中的潜力和进展。
摘要
ABSTRACT
外泌体是来源于内体的纳米囊泡，参与细胞间通信。它们是由多种细胞分泌的天然纳米载体，从材料角度看，具有广泛的药物递送和治疗应用潜力。外泌体具有磷脂双层膜，表面装饰有功能分子，并且包裹着母体基质，这使得设计/混合工程化外泌体纳米载体成为研究热点。外泌体的结构多样性使得可以通过基因工程、化学处理、物理技术和微流控技术等多种方法对其原始构型进行改造，从而将额外的货物加载到外泌体中，以拓展其生物医学应用。外泌体在克服传统纳米粒子技术在靶向治疗中的局限性方面展现了巨大的潜力。本文回顾了外泌体的来源、特性、混合外泌体、类外泌体纳米囊泡和工程化外泌体作为潜在载药工具在治疗应用中的最新进展。
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01
生产杂化外泌体 （HE） 的策略
尽管外泌体引起了广泛关注，但其在治疗中的应用仍受到一些限制，例如外泌体的生产、在常温环境下的稳定性以及储存条件下的聚集等问题。
聚合物纳米粒子具有更好的稳定性和更高的载药能力等优势。然而，它们也存在一些问题，如生物相容性差、循环时间长和毒性等。
为确保内源性功能（如结构完整性和功能特性）和丰富性（高产量和高纯度），提出了将脂质体和外泌体融合成的混合外泌体（HEs）作为替代方案，并作为开发药物递送系统的有前景的候选者。
传统上，纳米医学中有三种主要的混合策略：自上而下、由下而上和生物混合策略。Li等人在他们的综述中简要描述了每种方法。这些策略如下图所示。
图1 探索制备 HE 的杂化策略的示意图
02
杂化外泌体 （HEs） 开发及其应用
最近开发的化学修饰外泌体纳米载体是应用于先进药物承载系统的宝贵生物材料。通过冻融法将外泌体膜与脂质体融合。
HEs可以通过修改脂质成分或外源性脂质特性来改变与细胞的相互作用，从而成为用于高级药物递送系统（DDSs）的纳米载体。
图 2 用于使用冻融技术设计 HE 的膜融合方法示意图
Piffoux等人开发了一种技术，通过与脂质体融合来改造细胞外囊泡（EVs）。具有化学修饰脂质体的EVs与聚乙二醇（PEGs）结合，成为理想的合成混合载体。这一过程有效地利用外源性亲水或亲脂化合物丰富了EVs，同时保持其原始特性。此外，负载的meta-四（羟基苯基）氯化物（mTHPC）相比裸药物或药物结合的脂质体前体，显示出增强的细胞递送效果。
图 3 PEG 介导脂质体和 EV 之间的融合
将替莫唑胺（TMZ）和siRNA封装到巨噬细胞来源的外泌体中，并与光热响应性脂质体（PMRTs）融合，以便通过级联靶向药物递送系统轻松将药物递送到大脑中。结果表明与单一治疗组相比，该联合治疗显著且协同地抑制了胶质干细胞（GSCs）的数量，并逆转了TMZ耐药性；与仅使用PM组相比，PMRT系统在近红外（NIR）照射下对基因转染的效果显著增强。该结果表明PMRT系统能够准确地将药物递送至跨越BBB的肿瘤区域。
图 4 HE 融合和 NIR 治疗下的治疗过程示意图
尽管HEs方法相比大规模构建和表面修饰的外泌体已显示出令人鼓舞的效果，但外泌体作为药物递送系统的开发仍在进行中。
03
类外泌体纳米囊泡及其重要性
类外泌体纳米囊泡（ELNVs）是一种生物纳米结构，大小在50-500纳米之间，由脂质、蛋白质和核酸组成。
随着对外泌体研究兴趣的高涨，ELNVs也开始被提取或生成。具有类外泌体特性的全新纳米囊泡可能具有治疗潜力。
植物来源的ELNVs
🔹 植物来源的ELNVs（PELNVs）可传输多种成分，包括具有生理活性的代谢物、蛋白质、脂质和核酸，使它们成为能够改变受体细胞代谢表型的微小而强大的载体
🔹 PELNVs不会携带人畜共患病或病原体感染
🔹 PELNVs具有非免疫原性的优势，因而在体内的循环时间更长，生物利用度更高
🔹 PELNVs可来源于多种植物，如水果（葡萄、柠檬、苹果、草莓）和根部（生姜、大蒜、胡萝卜）
🔹 来自根部提取的PELNVs具有类外泌体的特性，富含多种不同种类的RNA和蛋白质，且与水果提取物的极性不同
真菌来源的ELNVs
🔹 真菌来源的ELNVs（FELNVs）是一种双层纳米颗粒，大小范围为100到260纳米
🔹 FELNVs中的miRNA通过含有的功能域可以干扰微管相关单加氧酶、钙调蛋白和LIM结构域蛋白2（Mical2）的表达，并可能通过跨界调控机制在人体永生化角质形成细胞系（HaCaT）中发挥作用
尽管ELNVs与外泌体类似，但它们也存在显著的缺点，例如提取和纯化过程较为耗时，且在封装特定化合物的效率方面较低。
04
外泌体工程和表面功能化
外泌体的外表面或内腔均可用于治疗应用中的改造。改造后的外泌体可以通过多种方式获得。标准方法是孵育，即从细胞来源中自然释放出已装载有治疗性基团和功能性分子的外泌体内腔内容物。在基于亲本细胞的方法中，工程外泌体从细胞中释放出来，随后被分离。然而，在其他情况下，分离的外泌体会经历一个工程过程。
基于亲本细胞的外泌体表面展示
尽管在将干扰RNA和化疗药物加载到外泌体中取得了一些进展，但对于外泌体合成过程中货物短缺的机制仍缺乏了解，这使得复杂的蛋白质分子很难被有效地包裹到外泌体中。
一种基于宿主细胞的方法被应用于外泌体的制备。外泌体信号肽通常用于将蛋白质靶向到外泌体的外层。Lamp2b，作为一种与溶酶体连接的膜蛋白，是外泌体信号肽的一个例子。靶向蛋白质到外泌体外层的独特标准是将必需蛋白与Lamp2b融合，该融合基于片段、配体或受体。
其他常用于在外泌体表面展示融合蛋白的分子包括四跨膜蛋白、糖磷脂酰肌醇（GPI）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）和乳腺蛋白（C1C2区域）。
外泌体表面可以展示外泌体蛋白，如囊泡性口炎病毒糖蛋白（VSVG）。VSVG含有跨膜区域和细胞质区域。通过使用其他蛋白替代VSVG的细胞外和细胞质区域（例如，荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）），可以在不改变标志性肽和跨膜空间的情况下，合法地实现蛋白质在外泌体表面的富集。使用 VSVG 融合蛋白的外泌体表面呈递有利于改善靶细胞对外泌体的摄取，并通过蛋白质表面显示增强。
图 5 来源于基因修饰后代细胞的外泌体可以用于多种目的，包括诊断、成像和治疗。
化学修饰
化学修饰是改变外泌体外层的最有前景的策略之一。表面功能化可以用于在外泌体上形成巨型生物分子，以将药物递送到靶位点。例如，可以通过共轭化学改变外泌体蛋白的氨基组，进而对炔基进行功能化。
点击化学是一种可行的化学共轭方法，用于将感兴趣的底物连接到特定的生物分子，这一过程被称为生物共轭。外泌体可以通过使用带有染料的化学基团以及含有叠氮基的模型蛋白来进行分离，这个过程用于验证概念或证明某种方法的可行性。
HER2抗体与纳米囊泡的表面连接，并加载了光热诊疗剂，例如荧光素绿（ICG），用于治疗肝门部胆管癌（PHCC），在光照射下，该方法展现了更好的抗癌效果。
图 6 使用 A-NVs@ICG 的 PHCC 成像引导治疗示意图
聚合物和外泌体的杂化
快速从体循环中清除的外泌体可能会随着时间的推移发生聚集，并释放表面蛋白，从而限制其临床应用。
通过使用透明聚合物对外泌体表面进行深度控制和可逆功能化，有可能改善其物理化学性质和药代动力学特性。为了实现先进且精准的材料设计和应用，需要强有力的表征技术，以便从根本上理解合成和制造原则。
来自小鼠巨噬细胞的外泌体与cCHP纳米凝胶混合，形成了混合物HEs。通过透射电子显微镜观察，显示了外泌体的外层被cCHP纳米凝胶颗粒覆盖。流式细胞术分析发现，大量HeLa细胞被此外泌体/纳米凝胶混合物吸附。该内迁过程是通过内吞作用介导的。纳米凝胶支架有效地将活性外泌体运输到细胞中，证明了它们能够在受体细胞中引发神经样分离。这种混合纳米载体框架可用于将各种物质加载到外泌体中，并确保它们在可行状态下的递送效能。
图 7 表面改性的外泌体-聚合物杂化物
基于亲本细胞的外泌体工程
干细胞转化为分泌所需的载货外泌体是通过将干细胞与所需分子一起孵育并封装在外泌体中来实现的细胞转化后，分泌含有所需分子的外泌体并从转化的细胞中分离出来。
药物分子的包封是治疗性外泌体合成中的常见需求。将所需蛋白质封装进入外泌体，同时避免对细胞膜或货物生物活性造成损害，是主要的挑战。
除了基于母细胞设计的外泌体策略和用于蛋白质封装的技术外，还开发了用于堆积RNA的类似技术。
特定mRNA的EXOtic设备极大地提高了未来应用中的加载效率。mRNA可以通过母细胞封装，且该细胞基技术称为EXOtic技术（外泌体转移至细胞）。在EXOtic技术中，除了RNA加载框架之外，还使用了靶向模块。这为封装治疗性mRNA至外泌体提供了新颖技术。在该技术中，带有3' UTR C/D框序列的mRNA通过过氧化氢酶催化被封装至外泌体，同时Lamp2bRVG靶向模块可靶向脑组织。
图 5 细胞货物装载技术示意图
植物中提取类似外泌体的纳米微粒
工程化的可食用植物能够以低成本方式向人体递送siRNA，从而以高效、安全、无害及化学预防的方式抑制恶性生长。
研究发现，治疗性负载效率低于正电荷分子;与短RNA相比，mRNA和DNA无法通过电穿孔整合。
此外，还可以采用被动负载方式，将源细胞利用病毒或非病毒纳米载体转染所需的载荷，以利用ELNV生成的生物过程。这些技术将使RNA加载到PELNV上更加容易，并且由于其有望克服现有的限制，因此将扩大基因递送的应用范围。
通过植物生物工程生成任意所需序列的miRNA是一项出色的技术，而利用可食用植物生成治疗性miRNA在各类应用中具有巨大潜力。
目前，现有的植物源纳米载体能够以稳定和活性的形式有效递送合成RNA。
增强细胞内输送
细胞对外泌体的摄取是通过多种机制实现的，包括直接膜融合、吞噬作用和内吞作用。为了促进细胞渗透，必须使用先前提到的方法对外泌体进行修饰。
细胞穿透肽（CPPs，如富含精氨酸的CPPs）可通过细胞的大吞饮作用提高外泌体的内化。
鞘脂和胆固醇增强了膜的刚性，进一步提高了外泌体与受体细胞结合的效率，并增加了膜融合的可能性。
外泌体的摄取机制还取决于受体细胞的特性。
05
天然外泌体和工程外泌体的比较
06
工程外泌体的生物安全性和生物分布评价
原则上，具有活性、免疫原性、自降解性且免疫原性较低的纳米载体可能有助于解决这一问题。通过改变外泌体的表面或基因，可以主动或被动地靶向由自体组织产生的外泌体，而不会引发免疫或炎症反应。这些特性使外泌体在改善化学药物生物兼容性方面优于其他载体。
合成纳米载体，如脂质体、高分子纳米颗粒和无机纳米颗粒，在生物分布和生物可用性方面无法与外泌体相提并论。
外泌体是天然产生的，具有较长的体内半衰期，并且能够转运内源性生物分子，因此相比脂质体和基于病毒的药物递送系统，外泌体成为了有前景的潜在候选者。由于其天然来源的生物兼容性以及能够通过生物屏障，包括血脑屏障（BBB）。
由于其表面配体和受体，外泌体能够渗透到深层组织。因此，分子、基因和功能性生物分子可以递送到特定的组织或细胞，用于不同的应用。
07
外泌体生物降解可持续性在疾病治疗中的作用
外泌体的外层膜结构能够防止内部载荷被清除和降解，从而提供足够的稳定性用于药物递送。外泌体具有类似的稳定性因子，能够运输RNA、DNA和蛋白质等物质。它们通过与溶酶体或自噬体融合进行降解，而有些外泌体可以绕过溶酶体降解，完成信号传导功能。外泌体在与靶细胞的相互作用中表现出高效性，表面富含四跨膜蛋白和整合素，有助于它们与目标细胞的附着。
因此，外泌体在治疗中表现出较高的积累和传递效率。
08
工程外泌体的临床评价
为了确保临床应用的一致性，必须解决大规模生产中的质量和安全问题。细胞培养条件、分离、表征和储存等多个参数需要在临床转化过程中保持和控制。外泌体的分泌可以通过提高细胞内钙离子浓度或血清饥饿进一步改进。外泌体的保存是临床评估的重要要求，温度变化会影响其大小。外泌体的分泌主要依赖于细胞系和培养条件，这也限制了外泌体在临床应用中的可行性。为了克服这些问题，研究人员正在开发工程化外泌体以改善治疗效果。
工程化外泌体已被用于靶向特定器官和组织。通过转染特定基因，外泌体可富集某些分子（如MHCII），用于提高免疫反应和抗肿瘤免疫。外泌体表面还可以通过附着抗体链来靶向T细胞。设计过的外泌体还可以通过特定肽（如GE11）靶向肿瘤细胞，针对一些上调的受体（如EGFR）进行癌症治疗。
09
结论和未来方向
纳米技术的进展正在改变我们的生活，并推动下一代纳米诊疗技术的创新。过去二十年，基于外泌体的研究因其生物相容性、安全性、在消化道和其他体液中的稳定性，以及通过血脑屏障（BBB）的能力，极大地丰富了纳米医学研究。外泌体被广泛应用于基因治疗、组织再生和疫苗开发等领域。
尽管外泌体已在多种动物模型中得到测试，并展示了巨大的潜力，但其临床应用仍面临低产量、纯度、载药效率和成本等挑战。为了实现临床转化，必须提高外泌体的产量而不牺牲治疗效果。通过基因工程和表面修饰，外泌体能够实现特定药物的靶向递送和高效细胞摄取。未来，通过改进外泌体的生物生成途径，如调节Rab蛋白、培养条件和微环境等，可以进一步提高外泌体的产量和功能。
尽管外泌体已展示出在癌症治疗和疫苗开发中的潜力，仍需克服一些技术障碍。未来，外泌体将在靶向药物递送、疫苗开发等临床应用中发挥重要作用，并推动新型治疗方法的广泛应用。
参考文献：Mondal, J., Pillarisetti, S., Junnuthula, V., Saha, M., Hwang, S. R., Park, I.-K., & Lee, Y.-K., Hybrid exosomes, exosome-like nanovesicles and engineered exosomes for therapeutic applications, Journal of Controlled Release, 2023, 36528193.
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