新闻资讯
聚焦前沿科技，传递行业声音
抗蛇毒新药研发新工具：无细胞体系制备功能性 SVMP 毒素
发布时间：
2026-07-16
毒蛇咬伤是一类严重危害人类健康的疾病, 致死率和致残率高。据统计, 每年有180~270万人在被毒蛇咬伤后引起严重的临床疾病。蛇毒成分复杂, 蛇伤机制不明, 蛇伤患者死亡率、致残率较高, 毒蛇咬伤的治疗依然是目前极具挑战性的课题[1]。
蛇毒金属蛋白酶（SVMPs）是蝰蛇毒液中含量丰富的毒素，是引发局部及全身中毒症状的核心毒素。但这类毒素的研究一直卡在一个老大难问题上：表达与纯化。今天小编和大家分享一篇发表在《Amino Acids》上的一项研究“Recombinant expression of the precursor of the hemorrhagic metalloproteinase HF3 and its non‑catalytic domains using a cell‑free synthesis system”，该研究不仅首次成功表达了高出血性SVMP的前体蛋白，还拿到了有活性的非催化结构域，为这类毒素的结构功能研究打开了新大门。
一、研究背景
SVMPs参与蛇咬伤后的病理过程，如出血、炎症和坏死。这些酶以潜在的多结构域前体形式合成，经加工后可产生具有催化活性的酶或游离的非酶结构域。目前SVMPs被分为三大类：P-I型、P-II型和P-III型。然而，由于多结构域多肽结构不稳定，P-III类SVMPs前体的重组表达一直未能成功。
二、研究结果
- HF3前体及其非催化结构域的无细胞合成
研究团队利用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统（CFPS），成功实现了高出血性SVMP——HF3及其前体和非催化结构域的重组表达。其构建的三种表达载体（如图1a），分别对应HF3的不同片段：PMDC（全长前体，77kDa）、DC蛋白（28 kDa）、C蛋白（18 kDa）。
实验设计亮点：
- CFPS体系：采用基于大肠杆菌的CFPS系统以及大规模透析模式，无宿主毒性，翻译环境可控，折叠空间充足，可以持续补充底物并移除副产物，延长反应时间（16小时）。
- 条件优化： 测试了16、18、20mM三种乙酸镁浓度，还试了两种谷胱甘肽比例（还原型GSH：氧化型GSSG=4:1和1:4）来调节氧化还原环境，帮助二硫键正确形成。
图1：采用基于大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系统表达重组蛋白
结果发现，镁浓度对表达量影响不大（如图1b），加不加谷胱甘肽也没明显区别（如图1c）。在30°C条件下合成16小时后， PMDC 、DC和C均被正确表达（如图2）。质谱分析证实，这些蛋白的序列与预期的HF3序列完全一致。
图2：采用批量无细胞合成法表达HF3的前体蛋白（PMDC）及其非催化结构域（DC和C）
2.发现非催化结构域的“靶向”功能
表达出蛋白只是第一步，关键要看它们是否具有生物学功能。研究团队重点测试了DC和C蛋白与天然底物的相互作用，以及对HF3酶活性的影响。
- 固相结合实验
研究人员将 I/IV/VI 型胶原、纤维蛋白原、基底膜基质 Matrigel 包被微孔板，使用梯度浓度 DC、C 蛋白孵育检测其结合能力。结果发现，DC蛋白可以和所有这些基质蛋白结合，而单独的C蛋白只能微弱结合胶原蛋白I，和其他蛋白几乎没有相互作用。
图3：固相结合实验测定DC结构域和C结构域与I型胶原、IV型胶原、VI型胶原、纤维蛋白原及Matrigel™的结合情况
- 纤维蛋白原水解实验
纤维蛋白原是SVMPs的核心底物，研究人员将重组DC蛋白和C蛋白与纤维蛋白原预孵育后再加入HF3。结果发现，在两种酶-底物比例及孵育时间条件下（1:100,1小时；1:200,2小时），DC、C 均能剂量依赖性抑制 HF3 切割纤维蛋白，表明非催化结构域参与引导HF3靶向纤维蛋白原进行降解。此外，固相结合实验中C蛋白虽无法与纤维蛋白原结合，却仍能改变HF3对纤维蛋白原的切割方式，这说明纤维蛋白原的构象对该相互作用的发生至关重要。
图4：DC结构域和C结构域对HF3酶切割纤维蛋白原的影响
综上所述，这些结果表明通过无细胞合成获得的重组DC蛋白和C蛋白在溶液环境中均能有效与纤维蛋白原相互作用，并干扰天然HF3正确结合以进行蛋白质水解。
三、结论
大肠杆菌无细胞表达技术已成为制备重组野生型及突变型SVMPs的理想替代方案。HF3蛋白的前体已被成功表达，该研究结果表明，DC蛋白具有功能性，并重现了HF3蛋白DC结构域的部分特性。
四、前景与未来展望
该研究首次证明，大肠杆菌CFPS体系可高效制备富含二硫键的全长 P-III 型 SVMP 前体，解决传统活细胞表达的三大痛点：
- 规避蛋白酶对宿主的细胞毒性；
- 改善大量半胱氨酸蛋白折叠效率，降低包涵体生成；
- 直接获得无多余标签、具备原生生物活性的重组蛋白。
这套方案或可复制到其他高半胱氨酸动物毒素、多结构域金属蛋白酶，为基质金属蛋白酶、毒素结构生物学研究提供低成本、快速的蛋白制备工具。
此外，对于从事抗体药物、毒素研究或结构生物学的同行来说，面对那些“富含二硫键”、“易聚集”、“对宿主有毒”的蛋白时，不妨跳出传统的细胞表达思维，试试无细胞合成。
参考文献：
- DONG De-gang, WANG Wan-chun, DENG Zhong-ping. Advances in snake venom studies:from lethal toxins to new drug development. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020, 55(9): 2019-2026.
最新新闻
联系方式
服务热线 : 0512-67900128
客户服务 : order@sz-pld.tech
商务合作 : bd@sz-pld.tech
地址 :苏州工业园区界浦路69号维力医疗科创园1号楼302室
