抗体研究的重要性不言而喻，尤其在经历了新冠肺炎之后，越来越多的企业投身到抗体药物的研发中。然而，在抗体药物研发和产业化过程中，存在多个层面的技术挑战和瓶颈，比如：

靶标识别困难：对于某些靶标蛋白，特别是那些结构复杂或者具有多个表位的蛋白，找到能够高度特异性结合的抗体往往十分困难。

抗体亲和力与特异性的平衡：高亲和力的抗体能够更有效地结合靶标，但过高的亲和力可能会增加不良反应的风险。

免疫原性问题：某些抗体在人体内可能引起免疫应答，导致抗体被自身免疫系统识别并清除，从而降低了治疗效果。解决这一问题需要设计更为安全的抗体分子。

生产工艺难度：实现规模化、高效且经济的抗体生产是一个关键技术难题，包括提高细胞株的表达水平、优化细胞培养工艺以及降低成本和增加产量。

高通量筛选技术的限制：尽管现有的筛选技术已经相对成熟，但要从庞大的抗体库中筛选出具有理想特性的抗体仍然是一个耗时且成本高昂的过程。

成本和时间：抗体的发现和开发涉及复杂的实验设计和大量的资源投入，从候选抗体的发现到临床应用通常需要数年甚至十多年的时间，且成本高昂。

今天和大家分享一篇发表于 Nat Commun. 期刊(Q1/1区/16.6)上题为“A rapid cell-free expression and screening platform for antibody discovery”的文章，希望可以给做抗体研发的小伙伴提供一点新的思路。

一、介绍

该研究开发了一种用于抗体发现的快速无细胞表达与筛选平台，研究团队通过整合无细胞DNA模板生成、无细胞蛋白质合成以及抗体片段结合测量技术，大幅缩短了评估时间，从以往的数周缩短到几个小时。该流程使单个研究人员能够在不到 24 小时的时间内表达和分析数百种抗体的抗原特异性结合。工作人员应用此工作流程分析了135 种先前发表的针对 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白的抗体，并成功识别了 8 种效力好的中和抗体，这些抗体已获得美国食品和药物管理局授予的紧急使用授权 (EUA) 用于治疗 COVID-19。此外，还筛选了 119 种源自免疫 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白的小鼠的抗体，并鉴定了几种候选中和抗体。

图1：快速无细胞抗体筛选工作流程

二、结果

1.开发无细胞DNA组装和扩增的工作流程

该流程包括两个关键步骤：首先采用Gibson组装方法拼接编码所需重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的双链线性DNA，随后直接以未纯化的Gibson组装产物为模板进行PCR扩增，生成线性表达模板(LET)。这一过程在384孔板上3小时内即可完成，无需细胞培养，具有高效灵活的特点。为了验证该方法的有效性，研究小组将其应用于sfGFP的组装和扩增，并证实只有当DNA模板正确组装时才能观察到sfGFP的表达。此外，通过该工作流程，研究人员可以迅速地将单个抗体片段组装成不同形式，只需在组装反应中添加不同的抗体恒定区序列即可。这一快速无细胞DNA组装和扩增技术显著加快了抗体基因构建的速度和灵活性，是整个无细胞抗体筛选平台的重要组成部分。

2.用于抗体片段表达的CFPS系统

研究团队开发了一种基于粗提物的无细胞蛋白质合成系统，用于快速表达抗体片段。该系统源于携带trxB和gor基因突变的大肠杆菌 OrigamiTM B(DE3)菌株，能够在胞浆内形成二硫键。通过预处理粗提物加入还原酶抑制剂以及补充特定的E. coli酶，成功从线性DNA模板实现了全长曲妥珠单抗(抗HER2抗体模型)的表达。鉴于全抗体组装优化的需求，研究转而聚焦于合成二聚化抗原结合片段(sdFab)，研究表明其在CFPS系统中的组装一致性优于Fab片段。此外，团队通过声波液体处理技术，将CFPS反应装配至384孔板中，实现快速、高度并行的抗体片段表达和筛选。

3.评估抗体片段的结合和组装

在DNA组装和CFPS之后，对抗原特异性结合进行了评估。为了表征表达的sdFab抗体候选抗体的PPI，开发了AlphaLISA方法来评估直接从CFPS反应中结合。AlphaLISA是一种免洗涤、高通量、适用于粗裂解液的解决方案检测方法，它通过化学发光原理捕捉并量化靶蛋白与抗体片段的相互作用。在优化CFPS条件后，研究人员利用AlphaLISA建立了测量直接抗原结合、竞争性结合、交叉连接及蛋白质复合体形成的策略。为了验证AlphaLISA剖析中和抗体的能力，测试了四种不同商业抗体与SARS-CoV-2靶人体受体血管紧张素转换酶2(ACE2)竞争以结合SARS-CoV-2受体结合域(RBD)的能力。确定的IC50值排名顺序与报告的ELISA IC50s非常一致。此外，我们利用AlphaLISA开发了一个sdFab装配屏幕，以监测CFPS中的抗体片段表达和装配。

4.评估大量之前发表的抗体

研究团队采用自主研发的无细胞抗体表达与筛选平台，对先前已发表的115种针对SARS-CoV-2的靶向抗体进行了评估。为了确定工作流程的鲁棒性，抗体片段做三份表达和评估。总的来说，这些数据表明，该工作流程可用于表达和评估人类抗体片段，作为过滤器，以选择进一步发展的潜在候选者。

图2：评估 SARS-CoV-2 中和抗体的游离抗体片段筛选工作流程的性能

5.高关注度的SARS-CoV-2抗体的表达和评估

接下来，该研究表达并评估了美国食品药品监督管理局以前获得紧急使用授权(EUA)用于预防/治疗新冠肺炎的8种抗体，以及其他11种抗体。通过AlphaLISA技术，团队检测了这些抗体片段对S6P、RBD的结合力以及与ACE2的竞争性，结果与文献记载相符，且能准确识别出最有效价的中和抗体。特别是对新出现的受关注变的异株，这些抗体的结合特征也被细致分析，显示出对多种SARS-CoV-2变异株以及其他冠状病毒的广泛交叉反应性。该工作流程有力地验证了其在快速筛选和鉴定有潜力的抗体候选物方面的价值。

图3:评估高关注度的COVID-19中和抗体

6.从免疫小鼠身上发现SARS-CoV-2抗体

研究团队采用无细胞筛选平台，对免疫SARS-CoV-2刺突蛋白的小鼠产生的抗体进行了发掘。通过荧光激活细胞分选技术分离出Spike蛋白阳性的活化B细胞，并对其序列进行测序，筛选了119种不同的抗体片段。通过AlphaLISA技术，团队对这些抗体片段与S6P、RBD及ACE2的结合能力以及sdFab组装情况进行了全面评估，结果显示良好的实验重复性。最终，该平台成功鉴定出了一系列具有中和潜力的候选抗体，其中抗体SC2-3表现出对所有测试过的SARS-CoV-2变异株的广泛结合能力。这些数据表明，该研究开发的工作流程可用于发现结合目标抗原的抗体。

三、总结

该研究提出了一种创新的无细胞抗体表达与筛选平台，显著缩短了抗体发现和评估的时间周期，从传统的数周降低到数小时。研究团队将无细胞DNA模板生成、无细胞蛋白质合成与AlphaLISA蛋白相互作用检测相结合，形成了一套完整的流程，可用于快速筛选并评估针对SARS-CoV-2等多种目标抗原的抗体片段。

无细胞工作流程设计考虑了自动化和高通量操作，各个步骤简易易行，通过标准化的液体处理和温度孵育即可完成，虽然目前还需要人工干预，但因其结构简单，未来很容易实现端到端的自动化操作。无细胞蛋白表达平台在大规模筛选抗体中展现出了巨大潜力，有望助力研究人员快速发现并深入研究对抗未来大流行病或其他疾病的有效抗体疗法。

珀罗汀生物于2017年在苏州工业园区成立，是一家专业的无细胞蛋白表达生物技术公司。公司拥有国家高层次领军人才、海归博士等人才组成的专业技术团队，以自主研发独具特色的无细胞蛋白表达技术平台为依托，为广大生物医药、合成生物学等企业、研究机构提供无细胞蛋白表达产品、蛋白原料试剂及定制化服务。