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新工具 get！难表达蛋白原来可以这么做

发布时间：

2023-08-11

难表达蛋白（DEPs：difficult-to-express proteins ）是指在传统表达系统下难以表达、分离、纯化和研究的蛋白质，包括类毒素、膜蛋白（MP）、酶、抗体和一些难溶于原核表达系统的蛋白质。这些蛋白质对于生物学、生物医学和制药行业具有重要的意义，因为它们涉及到许多生理功能，如细胞信号传递、免疫反应、新陈代谢和肿瘤发生等，有潜力成为治疗学中最重要靶标，可以将它们开发为治疗性蛋白质，例如药物载体，抗体，抗菌剂和疫苗。目前，基于大肠杆菌的表达宿主占DEPs产量的很大一部分，因为它们具有相对简单且便宜。然而，依旧存在一些困难和挑战，包括低溶解度、低产量、结构不稳定和宿主毒性等。

为了解决这些障碍，无细胞蛋白质合成技术（Cell-free protein synthesis，CFPS）作为一种新型的蛋白制备方法，吸引了众多研究人员和制药企业的关注和投入。其优越的特性在难表达蛋白质研究和制备领域中呼之欲出。本文将详细介绍CFPS技术在解决难表达蛋白质方面的应用和前景。

图1 ：CFPS系统利用粗细胞提取物生产有价值的治疗方法和疫苗等

1.原理和优势

CFPS技术是一种在细胞外进行蛋白质合成的技术，该技术利用含有蛋白合成必需组分（核糖体，转运RNA，氨酰合成酶，启动/延伸/终止因子，三磷酸鸟苷，ATP，Mg2+和K+）的细胞裂解物在体外完成蛋白质合成的过程。相比传统蛋白质表达方法需要克服难以克服的细胞毒性、折叠和分泌等问题导致的表达低效和失败，通过 CFPS 技术可以避免这些问题，提高难表达蛋白的表达成功率。此外，由于CFPS系统相较于真正的细胞表达更为简便，也更有选择性，因此其可以用于生成更多类型的蛋白质以及进行更多样性的筛选实验，也更为适合成为高通量、高效率的表达平台。

总体而言，CFPS技术实现了“非细胞”蛋白合成，提供了一种便捷高效的蛋白质表达方式，能够有效避免由于细胞内环境给蛋白产生的各种限制与挑战。

图2：体内重组 DNA 蛋白表达与无细胞蛋白合成（CFPS）的比较

2应用

病毒样颗粒

病毒样颗粒（VLP）是由一种或多种结构蛋白自组装而成的 25-100 nm 复合物，它们在结构上与病毒相似，会引起免疫原性反应，但由于它们不含遗传物质，因此有可能被用作安全的疫苗。此次，它们的自组装和中空结构使人们对使用VLP作为药物递送和基因治疗剂产生了兴趣。由于界定和有规则的结构对于VLP的免疫原性反应很重要，因此重组生产中的关键考虑因素是VLP亚基的组成和一致性以及最终产品的纯度和分布。但是，在体内重组生产VLP具有挑战性，因为规模扩大中涉及的结构不一致、体内生产中的蛋白质杂质以及与重组菌株开发相关的高成本。

目前，基于大肠杆菌的CFPS平台已被开发出来，可以大大提高VLP的可制造性。例如：Bundy等人在批量CFPS反应中有效地合成了MS2外壳蛋白。

治疗性蛋白

随着成本、规模和蛋白质折叠问题不再是无细胞技术不可逾越的障碍，通过CFPS进行治疗药物商业化生产的力度将加大。并且有生产个性化药物的潜力。例如：使用大肠杆菌CFPS系统合成在特异性B细胞淋巴瘤表面发现的免疫球蛋白（Ig）独特型的细胞因子融合单链抗体片段（scFv）。

这种针对特定淋巴瘤的“个性化”scFv融合成功引发了针对天然Ig蛋白的免疫反应。与传统哺乳动物细胞表达的几个月相比，这种用于治疗淋巴瘤的纯化疫苗在几天内生产出来。快速、灵活和高产量表达治疗方法的能力，结合简单的下游加工，证明了基于蛋白质的患者特异性药物的令人兴奋的新可能性。

图3：无细胞疫苗诱导体液免疫反应；抗38C13抗体水平与Id KLH标准相当

膜蛋白

据报道，膜蛋白占所有潜在药物靶点的四分之三。然而，由于其复杂的结构、疏水性跨膜区、宿主毒性以及所需的耗时和低效的复性步骤，它们在体内的过表达仍然是一个瓶颈。

现在的证据表明，使用CFPS系统进行生化或结构研究时，有可能进行高水平的膜蛋白表达。关键点是在天然或合成的脂质、洗涤剂存在下合成膜蛋白，以帮助溶解膜蛋白。例如：添加纯化的大肠杆菌磷脂双层囊泡代替洗涤剂，使用这种方法，表达了两种膜蛋白，四环素泵（TetA）和甘露醇渗透酶（MtlA），并分别获得了570和130μg mL-1的高产率，是以前方法的400倍。

3发展趋势

难表达蛋白一直以来是蛋白质研究领域中的难点，传统的表达技术面临着重大的困难。随着无细胞蛋白表达技术的发展，未来在难表达蛋白中的应用前景和发展趋势将会更广阔。

无细胞蛋白表达技术的出现填补了传统表达技术无法解决的问题。目前，无细胞蛋白表达技术主要应用于一些难表达的蛋白质，例如，对分泌胞浆敏感、无法高效表达难折叠蛋白等。未来，技术的发展将着重在以下两个方面：

进一步提高CFPS技术在难表达蛋白中的应用范围

CFPS技术在难表达蛋白的应用中主要包括具有毒性、难折叠、对分泌胞浆敏感、无法高效表达的蛋白质等。未来可能将提高CFPS技术在难表达蛋白中的应用范围上，例如针对激素、中性粒细胞因子，以及在结构或功能上高度复杂、依赖于生产环境中特定细胞亚群水平调节的蛋白质等都。

提高技术的特异性和稳定性

目前，CFPS技术在表达具有复杂结构的蛋白质时仍为困难。为了解决这个问题，研究人员正在开发各种新的CFPS技术，例如模拟细胞环境的技术、提高通量和灵敏度等。这些技术的开发将加速无细胞蛋白表达技术的广泛应用，同时也有助于提高技术的特异性和稳定性。

4应用前景

无细胞蛋白表达技术在研究中的应用也越来越广泛。未来，无细胞蛋白表达技术在研究中的应用将围绕以下三个方向展开：

提高蛋白质生产效率和品质

高纯度蛋白质的快速生产是CFPS技术在产业界中的重点应用之一。同时，CFPS技术可以用于质量管理、非临床研究、毒理学评估、免疫学评估和原药提取等领域。这将带来全球医药与制药领域生产成本的降低，以及生产效率的提高。

基于CFPS的药物研发

近年来，CFPS在药物研发领域中的作用越来越受到重视。关于基于CFPS进行药物研发的研究，如蛋白质药物研究、基因疗法研究等，将有助于为药物的开发和生产提供便捷的工具技术手段。

新领域应用

CFPS技术不断拓展新应用领域，例如将CFPS技术与微流控系统结合使用，用于高通量生产和筛选。这些新兴领域中，CFPS技术的优势在于实验较为简单、快速产出、高纯度、低成本和可扩展性，因此在应用方面具有广泛的潜力。未来，CFPS技术将在新领域中继续发掘其应用价值，使得其在医学、制药和生物技术等领域中的作用更为广泛。

总结

随着无细胞蛋白表达术的不断发展和创新，它已成为一种高效实用的蛋白表达技术。未来，无细胞蛋白表达技术在难表达蛋白中的应用前景和发展趋势将会更加拓展和多样化。在这样的推动下，无细胞白表达技术有望在医学、制药和生物技术等领域中发挥更为重要的作用。

参考文献:

Carlson ED, Gan R, Hodgman CE, Jewett MC. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnol Adv. 2012;30(5):1185-1194. doi:10.1016/j.biotechadv.2011.09.016.
Chen JP, Gong JS, Su C, Li H, Xu ZH, Shi JS. Improving the soluble expression of difficult-to-express proteins in prokaryotic expression system via protein engineering and synthetic biology strategies [published online ahead of print, 2023 May 25]. Metab Eng. 2023;78:99-114. doi:10.1016/j.ymben.2023.05.007.
Zawada JF, Yin G, Steiner AR, et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnol Bioeng. 2011;108(7):1570-1578. doi:10.1002/bit.23103.
Kanter G, Yang J, Voloshin A, Levy S, Swartz JR, Levy R. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 2007;109(8):3393-3399. doi:10.1182/blood-2006-07-030593.
Khnouf R, Olivero D, Jin S, Coleman MA, Fan ZH. Cell-free expression of soluble and membrane proteins in an array device for drug screening. Anal Chem. 2010;82(16):7021-7026. doi:10.1021/ac1015479.
Wuu JJ, Swartz JR. High yield cell-free production of integral membrane proteins without refolding or detergents. Biochim Biophys Acta. 2008;1778(5):1237-1250. doi:10.1016/j.bbamem.2008.01.023.
Khnouf R, Olivero D, Jin S, Coleman MA, Fan ZH. Cell-free expression of soluble and membrane proteins in an array device for drug screening. Anal Chem. 2010;82(16):7021-7026. doi:10.1021/ac1015479.
Pattenden LK, Middelberg AP, Niebert M, Lipin DI. Towards the preparative and large-scale precision manufacture of virus-like particles. Trends Biotechnol. 2005;23(10):523-529. doi:10.1016/j.tibtech.2005.07.011.
Pattenden LK, Middelberg AP, Niebert M, Lipin DI. Towards the preparative and large-scale precision manufacture of virus-like particles. Trends Biotechnol. 2005;23(10):523-529. doi:10.1016/j.tibtech.2005.07.011.
Rothengass BE. Advocating for the quadravalent HPV vaccination, Gardasil, by Merck. Int J Pediatr Otorhinolaryngol.2007;71(4):671-673. doi:10.1016/j.ijporl.2006.12.007.
Bundy BC, Swartz JR. Efficient disulfide bond formation in virus-like particles. J Biotechnol. 2011;154(4):230-239. doi:10.1016/j.jbiotec.2011.04.011

珀罗汀生物位于苏州工业园区生物医药产业园，是一家专业的无细胞蛋白表达生物技术公司。公司拥有国家高层次领军人才、海归博士等人才组成的专业技术团队，以自主研发、独具特色的无细胞蛋白表达技术平台为依托，专业从事多肽、重组蛋白、基因工程抗体、重组疫苗以及大分子蛋白药物的研究和开发，同时为广大生物医药企业和研究机构提供无细胞蛋白表达产品、蛋白原料试剂及定制化服务。

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