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无细胞蛋白合成系统在酶促过程中的应用
发布时间：
2023-08-02
今天笔者和大家分享一篇由南京师范大学徐娴团队发表在《Critical Reviews in Biotechnology》杂志上的一篇综述文章，主题为“无细胞合成系统在酶促过程中的应用研究进展”。
研究背景
酶是一种生物体产生的催化剂，在合成生物学、医学生物制造等领域得到广泛应用。很多复杂反应需要多酶级联完成，通过物理或功能连接聚集形成复杂的代谢网络，提高了整体催化效率。在此基础上，代谢工程和合成生物学越来越多地被用于引入各种编码生物合成途径的外源基因，形成一系列多酶级联反应，实现从可再生原材料中合成高附加值的生物产品。然而，在人工构建非天然微生物合成途径的过程中，需要进行反复的设计-构建-测试循环，非常耗费时间和精力。
无细胞系统可以在不使用活细胞的情况下激活生物途径。根据应用的不同，可分为无细胞蛋白合成（CFPS）和无细胞代谢工程（CFME）。与传统的体内细胞反应相比，无细胞系统具有许多优点。它适用于在更广泛的条件下实施生物合成途径。
图1：CFPS系统分类示意图
图2：传统微生物生产和无细胞系统在蛋白质合成和生物制造方面的优缺点比较。
无细胞合成系统的应用场景
用于单酶反应的无细胞蛋白质合成
无细胞合成体系（CFPS）是使用细胞提取物在体外完成：转录、翻译、蛋白质折叠和修饰以及能量代谢的一种新技术。与传统的体内系统相比，CFPS系统有许多优点，如避免重复、昂贵和耗时的步骤，从而大大缩短了蛋白质合成、非天然氨基酸（UAA）的掺入、更容易控制翻译后修饰、更高的产物产率以及对有毒底物或产物的强耐受性。CFPS系统已经被广泛应用于蛋白质表达、生物制造、合成生物学、代谢工程等领域，具有广阔的发展前景。
毒蛋白
在CFPS系统中，使用不同浓度的tRNA和补给间隔，可以优化反应系统，高效表达蛋白，并增加其产量。例如可用于合成磷脂酶A1和onconase等有毒蛋白。CFPS系统还用于快速生产被认为是传统抗生素的可行替代品的活性抗菌绞痛蛋白，同时增加绞痛蛋白的溶解度。CFPS系统也可用于表达细胞毒性pierisin蛋白家族的新成员pierisin-1b。此外，一些典型的毒性蛋白质，如：限制性内切酶、细胞致死性膨胀毒素和人微管结合蛋白，由于其开放设计和早期研究中的直接操作，也可使用CFPS系统高度表达。
膜蛋白
CFPS系统在表达膜蛋白方面具有重要的应用前景，是合成不溶性膜蛋白的有效工具。将CFPS系统与膜模拟结构（如洗涤剂（如Triton X-100）或脂质体）相结合，可以防止膜蛋白沉淀，增加其溶解度和产量，使其正确折叠并保持活性。由于大多数膜蛋白具有药物靶点潜力，CFPS系统为药物开发提供了机会，能够更快、更有效地评估和生产药物相关蛋白靶点。
难表达蛋白
除了有毒蛋白质和膜蛋白外，一些蛋白质也很难表达。比如说有些蛋白质在翻译和折叠过程中对密码子使用和tRNA丰度有特定要求，有些蛋白质需要伴侣或特定的化学环境，有些蛋白质是由多个亚基组成的复杂蛋白质， Park等人使用在CFPS系统中与sfGFP共表达。快速有效地筛选最佳的初始密码子，以提高重组人红细胞生成素的翻译效率并提高其在大肠杆菌中的表达水平。基于重建的无细胞蛋白质合成系统，开发了一种体外转录tRNA的系统。
掺入非天然氨基酸
在蛋白质翻译过程中引入非天然氨基酸（UAAs）便于特异性地引入新的官能团，提高和改变工程酶的活性或稳定性。然而，在传统的重组宿主中，仍存在一些限制因素阻碍UAAs的掺入和修饰酶的表达。CFPS系统可以应用于优化蛋白质翻译过程中非天然氨基酸的掺入，并大大提高非天然蛋白质的表达水平。与传统技术相比，它大大加快并且简化了含UAAs蛋白的表达和筛选过程。此外，CFPS系统能够掺入对细胞有毒或受缓慢跨膜扩散限制的UAAs。该系统在酶工程和生物制造领域实际上具有无限的应用潜力。
基于多酶合成的无细胞代谢工程
上述CFPS系统主要用于生物催化或生物制造应用中单个关键酶的合成。然而，活细胞也包括大量的多酶级联反应，其中各种酶通过物理或功能连接聚集在一起，形成复杂的代谢网络，合成生命所需的所有物质。随着代谢工程和合成生物学在酶催化中的引入，人工设计细胞中异源多酶级联反应的生物合成途径成为可能。无细胞蛋白合成通过缩短反应时间和加速代谢途径优化可以很容易地扩展为无细胞代谢工程（CFME）的多路复用形式。与体内系统相比，CFME具有反应速率更快、对底物和产物耐受性更高以及易于分离产物的优点[89-92]，这为反应途径的级联优化提供了更大的机会。
基于纯化酶
基于纯化酶的系统由代谢途径中生产所需的许多纯化酶组成。这些酶在细胞中过表达，提取和纯化，然后在体外重组以组装代谢途径。由于每种酶组分的浓度和活性是已知的，因此纯化的酶系统允许精确控制反应条件和代谢途径。基于纯化酶系统的无细胞代谢工程可以用于根据所需产品“设计”最佳途径，并通过筛选和纯化具有强活性的酶来“构建”高效的体外系统。然后，可以轻松、快速、灵活地“测试”影响酶活性的因素，如酶比、酶浓度、pH和金属离子，以实现最大生产力。因此，基于纯化酶的CFME在调节和优化多步代谢途径方面提供了简单和灵活性，而这是全细胞无法实现的。
基于粗提取物
CFME（含有多种酶的大肠杆菌裂解物）是一种常用的粗细胞提取物，可用于构建各种生物途径，使构建、筛选、优化和调节过程更加高效。iPROBE（生物合成酶的外原型设计和快速优化）框架是基于CFME的快速组装大量生物合成酶的组合、优化和测试的方法，可加快代谢工程的设计-构建-测试周期。众多研究已经证明，基于粗提取物的CFME能够成功构建精细的代谢途径，从葡萄糖到正丁醇、甲羟戊酸、柠檬烯以及生物燃料的前体蒎烯和红没药烯等的合成都得到了成功，并且提高了产量。未来，基于粗提物的CFME有望应用于更多的酶工程和生物制造领域，为生物产品的生产提供更效的方法。
图3：iPROBE框架的示意图
无细胞合成系统的前景：与其他技术的结合应用
为了成功实现CFPS系统商业应用，可以通过引入新兴技术，提高酶在催化过程中的稳定性、重复使用能力和催化效率，降低工艺成本，以优化和改进CFPS系统，并充分发挥其优势。
合成生物学
无细胞合成系统与合成生物学结合将推动生物技术发展，并有望与新技术融合，合成意想不到的创新产品。在单酶反应方面，可通过CFPS来快速筛选新酶，无需繁琐的构建和验证步骤。在多酶合成方面，可使用CFME组装来自不同来源的基因，创造新型化学品和生物合成途径。以合成生物学为目的开发的CFPS无细胞表达系统，可用于制造复杂的生物制品或构建合成细胞，以重建多酶生物合成途径，从而创造生物多样性，实现新颖的产业化产品。
微流体技术
微流体技术和无细胞合成系统的结合可用于药物筛选和分析。研究人员设计微流体平台，用于测量蛋白质间相互作用，最终发现生物途径成员之间的新物理相互作用。这种多学科的方法将在酶工程、合成生物学、蛋白质组学、毒素检测等领域产生新的研究方向。同时，该技术还可应用于体外合成治疗蛋白质，大幅度提高蛋白质表达水平，有望生物制造和医疗领域实现新的突破。
辅因子再生
提高酶的稳定性和再生辅因子是降低无细胞合成系统成本的主要方法之一，其中再生辅因子最便宜的方法可能是开发一种用于耦合分解和合成反应的系统，使辅因子符合化学计量循环。一种潜在的再生辅因子的方法是使用电化学手段，它可以通过直接向氧化的NAD（P）提供电子和质子，再生生物活性的还原形式。此外，使用多种辅酶系统和酶电化学辅因子再生系统，无细胞体系也可以有效地合成多种化合物，例如：葡聚糖酸以及氢气等。
人工支架
人工支架技术与无细胞合成系统的结合将进一步促进合成生物学和生物制造中通路构建的发展。通过基于DNA人共支架上的多种酶级联反应，可以实现特定化合物的高效合成。将无细胞合成系统和支架相结合的策略可以作为设计生物合成多酶级联反应的通用平台，并为解决多酶级联和CFME系统中的问题提供参考和示范。
图4: CFME在多酶级联反应中的人工支架构建
结论
CFPS系统在酶促过程中的应用已经相对成熟，能够快速有效地合成：有毒蛋白质、膜蛋白质、难以表达的蛋白质和非天然蛋白质。基于模块化和工程设计的CFME应用于多酶级联反应，特别是在代谢途径的快速构建和优化方面，在高效、集中生产高价值产品方面具也有巨大潜力。CFPS系统与新兴技术的结合，为解决生物大分子代谢途径构建和调控问题提供了一种：简单、易于控制、方便、多变的策略。
展望
CFPS系统将使生物技术达到一个新的水平，并产生许多创造性和意想不到的结果。除了逐步优化无细胞合成系统外，我们还可以将无细胞系统与发酵技术相结合，最大限度地提高目标产品的产量，为生物制造行业提供更具成本竞争力的产品。
CFPS系统可能将为新酶和代谢途径的快速筛选和评估开辟新的领域，作为一个技术平台用于创新的医学诊断和治疗、复杂代谢途径的开发、功能性生物分子的制造以及可持续生物能源和生物化学品的生产，这些技术将广泛应用于各种有用的领域。
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