新闻资讯
聚焦前沿科技，传递行业声音
单分子技术与无细胞蛋白质合成：完美结合
发布时间：
2023-06-30
前言
今天和大家分享Analytical Chemistry（IF=8.008）杂志上的一篇文章，标题为“单分子技术与无细胞蛋白质合成：完美结合”。
近年来，在化学和生物学领域，单分子技术（Single-molecule techniques）和无细胞蛋白质合成（Cell-free protein synthesis, CFPS）发展迅速，并且已经成为热门研究领域；这两项技术之间的结合也将为生物医学、疾病治疗和材料科学等各个领域带来了新的机遇。
1.研究背景
单分子技术是目前研究蛋白质构象变化以及合成和折叠的重要工具，然而，制备合适的蛋白样品耗时耗力且要求高。随着无细胞蛋白质合成（CFPS）的发展，为快速简便的蛋白样品制备开辟了新的途径，它们之间的结合也为这些研究提供了更多机遇和挑战。例如，单分子技术能够精确测量蛋白质和核酸之间的相互作用，而CFPS能够快速高效的合成大量蛋白质，使得研究者能够更加深入地研究蛋白质结构、功能和相互作用。近年来，CFPS已作为常规技术用于单分子研究，一方面，CFPS是生产适当样品的理想选择，可用于研究蛋白质结构和构象动力学，并且可以利用单分子技术进行蛋白质合成和折叠；另一方面，单分子研究利用标准CFPS试验可以扩大它的应用范围。但是，到目前为止，单分子Förster共振能量转移 （smFRET）研究还没有从CFPS中获益，因此，本文主要是概述该领域所做的努力，而这些努力最终可以以更高的通量，制备微量样品和测试。
Fig1. 无细胞蛋白质合成和单分子技术的互补性
2.无细胞生产合适的蛋白质样品，用于精确的单分子FRET研究
单分子荧光共振能量转移（FRET）研究是一种非常精确且能够在单个分子水平上研究蛋白质结构和相互作用的技术，其中smFRET测量需要对蛋白质样品进行双重荧光染料标记，但这样可能会产生异质标记的群体，从而使数据分析困难。因此，人们对位点特异性和选择性蛋白质标记的替代策略产生了相当大的兴趣。
Fig2. 在无细胞合成蛋白质的情况下，微调选择性标记的水平
研究者通过将体内非天然氨基酸（UAAs）结合到蛋白质中，成功将各种新的官能团引入蛋白质中，并用荧光染料进行翻译后选择性标记。目前smFRET研究已成功使用酮-酰肼或烷氧基亚胺反应和铜催化叠氮化物-炔烃环加成等方法双重标记蛋白质，但这种方法对生物样品不太友好。为此，研究者通过厌氧条件下的CuAAC、使用水溶性配体和具有内部铜螯合部分的叠氮化物染料以及无铜点击反应等策略提高了生物反应相容性。同时，无细胞合成也成为了一种新颖的选择。虽然已经可以共翻译结合各种荧光氨基酸到蛋白质中，但这些荧光氨基酸的光物理性质和稳定性较差，不适用于单分子测量。因此，未来的挑战是将各种优势结合起来，以实现更好的双重标记策略。最近一项工作中，研究者利用CFPS将具有化学选择性的反应性对叠氮基-L-苯丙氨酸(AzF)掺入到蛋白质中，引入叠氮化物官能团实现荧光染料对蛋白质的选择性双重标记。该方法仅限于没有或很少半胱氨酸残基的蛋白质，但是非常适合进行smFRET研究。相比于体内法，无细胞方法更容易操作且扩大了蛋白质种类的范围，但需要选择合适的荧光团。未来需要同时掺入一对荧光团，以实现更好的smFRET研究。
Fig3. 根据smFRET数据的化学计量与FRET效率图评估突发数据
3开发分析工具和先进的技术方法
尽管CFPS的使用可能为smFRET研究提供有价值的样本，但获得足够的数据进行充分的数据分析仍然是一个挑战。在过去十几年中，各种smFRET检测方案和数据评估工具的发展使得分析CFPS产生的样本变得更加容易。由CFPS技术产生的蛋白质可以通过Ni-NTA磁性琼脂糖珠进行纯化，然后应用分类程序（脉冲交错激励（PIE）或交替激光激励（ALEX）等）去消除其他影响因素，从而得到符合质量标准的smFRET直方图。然而，根据合成的全长蛋白的总量和染料掺入或染料附着效率，在给定时间间隔内测量到的可接受爆发的数量可能会显著变化（见图3）。不过通过使用有效的排序程序和更长的数据采集时间仍然可以实现合理的计数统计。
CFPS生产的蛋白质目前依然存在样品量较小的限制，需要额外实验表征证明样品的结构和功能完整性。研究者可通过计算可及体积（AV）和量子产率值，以及使用位点特异性标记等方法来获得可靠且相当精确的染料间距离，从而为正确折叠的蛋白质结构提供了信息基础。这样的方法已经证明可以用于人类钙调素等蛋白质的研究。
4对该领域的贡献和未来展望
基于CFPS的蛋白质生产方法已经成功地用于各种模型蛋白质，钙调素、芽孢杆菌、血影蛋白、T4溶菌酶和葡萄糖结合蛋白等，表明其具有成为通用方法的潜力。为了进行更全面的蛋白质结构测定，需要快速、容易地生产一组显示多个距离对的样品，并使用高精度的距离测定来实现更好的蛋白质结构测定。CFPS方法可以完全控制任何具有smFRET标记的蛋白质的合成。
此外，微流体平台是一种有前景的方法，可用于推动CFPS和单分子荧光应用的结合向前发展。该平台集成毛细管电泳，可获得标记靶蛋白的有效纯化。CFPS与smFRET或其他单分子技术的结合展现了研究复杂生物过程的全部潜力，其中新生链的多肽链延伸和共翻译折叠是有价值的靶点。荧光标记新生链的能力对于了解蛋白质耦合合成和折叠非常重要。染料对的选择和灵活性对于单分子荧光研究至关重要。共翻译结合携带荧光染料的UAAs方法是目前比较好的双重标记方法。使用零模波导（ZMWs）进行平移和共平移折叠的实时观察，以及应用相关高分辨率力谱和smFRET测量组合的方法具有很高的潜力揭示共平移折叠的细节。
Fig4：用于观察原位合成反应的检测方案，通过使用ZMWs监测生长的新生链。
总结
CFPS主要通过使用市售的纯化和重组的体外系统来更好地控制翻译，从而掺入UAAs，这有可能成为未来生产用于smFRET研究的蛋白质样品更相关的方法，其优点是（i）CFPS能快速生产蛋白，并允许快速筛选可行的突变体，（ii）掺入非天然氨基酸，尽管与天然蛋白质合成的效率和特异性相比不足，需要进一步优化，但它仍然提供了位点特异性，最重要的是位点选择性标记方案，这是测量数据的最高准确性的基础，（iii）CFPS可以将应用范围扩展到有毒或难以表达的蛋白质。在这方面，CFPS和smFRET代表了一种完美的组合，可以充分利用基于荧光的技术分析蛋白质结构。
作者：杜静
最新新闻
联系方式
服务热线 : 0512-67900128
客户服务 : order@sz-pld.tech
商务合作 : bd@sz-pld.tech
地址 :苏州工业园区界浦路69号维力医疗科创园1号楼302室
