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无细胞蛋白合成：未来药物开发的新方向
发布时间：
2023-06-30
前言
今天和大家分享 BioDrugs（IF=7.74）杂志上的一篇文章，标题为“无细胞蛋白合成：未来药物开发的新方向”，概述了无细胞（CF：Cell-Free）合成平台及其各种应用的最新进展，以及无细胞蛋白合成（CFPS）方法如何在未来的药物开发中发挥重要作用。
1.研究背景
随着现代医学技术和药物研发的不断进步，传统的药物研发方式因其耗时长、费用高，已经不能有效的满足市场需求。因此，无细胞蛋白质合成（CFPS）技术开始逐渐受到研究人员的关注，它可以更加高效、快速地生成需要的蛋白质，并从中筛选出潜在药物分子，能够更加有效地开发新药物。本文讨论了CFPS技术的应用现状、前景和优势，对于药物开发具有重要的指导意义和借鉴价值。
2.技术优势
CFPS是一种快速蛋白质生产系统，因为它不需要转染或细胞培养，并且不会受细胞活力限制，相对于传统蛋白质表达技术具有显著优势，包括：快速、高效、灵活且易于扩展，从而大大提高了蛋白质表达的效率和质量，并能够在较短时间内大量生产所需的蛋白质。
table1.用于药物发现的体外（无细胞）和体内（基于细胞）蛋白质合成方式的比较
3.无细胞（CF：Cell‑Free）系统
CFPS平台是基于原核或真核来源的细胞提取物。其中原核CF系统中，经常使用基于大肠杆菌的提取物，并且可用于多种蛋白质的CFPS。在真核CF系统中，经常使用基于兔网织红细胞裂解物（RRL）、小麦胚芽、昆虫草地贪夜蛾21（Sf21）、中国仓鼠卵巢（CHO）等。
Fig.1无细胞蛋白质生产的总体过程的总体方案
3.1原核生物CF系统
包括基于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌和弧菌等细胞提取物的原核CF系统，其中大肠杆菌CF系统最常用于药物开发的蛋白质生产，并且经过改良和重组的PURE系统可高度控制蛋白质的合成过程，其翻译机制中的所有组分都被纯化，单独添加至反应系统，可以确定蛋白质合成过程中参与的各种因子，以单独适应CF系统的要求。
3.2真核生物CF系统
包括基于昆虫、兔网织红细胞裂解物（RRL）、小麦胚芽、中国仓鼠卵巢（CHO）、酿酒酵母、烟草BY-2和培养的人类细胞等提取物的CF系统。其中基于小麦胚芽裂解物(WGL)的CF系统是受欢迎的真核系统之一，该系统提取物产量高、质量好，能够高产真核蛋白。但不能包含所有如糖基化等PTMs，也不支持复杂的跨膜蛋白质，而基于昆虫细胞（Sf21）的CF系统则支持更多PTMs。当涉及到难以表达蛋白质时，这些细胞还是具有局限性的。
Table2. 不同CF系统及其重要特性的比较
4.反应方式
4.1基于批次处理的方式（batch-based）
该方法相对快速、便宜，是原核和真核CF系统中最常用的方法。这种方法相对快速且便宜，根据系统的不同，合成可以在1.5–3小时内完成。其中基于大肠杆菌的CF系统可以实现从100µg/mL到2–3 mg/mL的蛋白质产量。基于真核生物的系统蛋白质产量相对较低，但MPs会自动集成到微粒体膜中，并在合成后立即发挥功能。并且为了进一步扩大蛋白产量，提出了一种重复批次合成方法，即将初始合成反应中产生的含有目的膜蛋白的微粒体添加到已经耗尽微粒体的新鲜CF合成反应中。
4.2连续交换无细胞合成平台（CECF）
通过半渗透透析膜分离反应室和进料室，进料室提供新的反应组分，同时富集反应室，并移除反应过程中积累的抑制成分。通常，CECF格式可以延长反应时间并增加蛋白质得率。到目前为止，CECF方法已被用于多倍增加蛋白质产量，并被广泛用于CF平台。
5.影响参数
5.1基因设计
添加调控元件设计DNA序列，在CF合成中起着重要作用。真核细胞CF系统中，起始因子限制蛋白质合成，导致低蛋白质产量，但可通过使用病毒基因组上游的IRES元素、替换起始密码子或进行密码子优化等方式来大大提高蛋白质产量。使用蜜蜂蜂毒肽 ER特异信号序列或加入反剪接头寡核苷酸也可提高蛋白质产量。
5.2反应条件
开发高产率CFPS需要迭代优化过程，包括反应温度、反应时间、质粒浓度、盐浓度、聚合酶等因素的优化。通过控制pH稳定和充足的ATP供应，可以提高蛋白质产量。最近报道了使用CECF方法高效CFPS合成CHO裂解液中的hTLR9，其蛋白质产量约为0.9 mg/mL。
5.3外部填充剂的影响
CF过程中伴侣蛋白的补充可以促进蛋白质功能折叠。在原核CF系统中添加伴侣蛋白可大大提高肠绞痛素M的产量和稳定性，增强细胞的杀伤活性。离子浓度（钾和镁）对蛋白质产量有显著影响。在基于CHO的真核系统CECF反应中，增加镁离子（Mg2+）浓度可大大提高EGFR的产量。
6.具体应用
6.1膜蛋白（MP）合成
MP是蛋白质的一种，占人类基因组编码蛋白质的30%。由于跨膜结构域等原因，传统的基于细胞的表达方法具有挑战性，基于微粒体的CF合成策略被广泛采用。基于脂质体的重建和纳米盘的非洗涤剂策略也可以直接补充到反应混合物中。MP包括离子通道、转运蛋白和GPCR，是制药行业40%以上的主要药物靶点。
离子通道和转运器
离子通道和溶质载体（SLC）家族转运蛋白在多种生理过程中发挥着重要作用，是新兴的药物靶点。
G蛋白偶联受体（GPCR）与无细胞系统中的药物发现
GPCR在细胞内外的信号转导中具有重要作用。目前，使用放射性标记或荧光标记配体结合测定、受体介导的G蛋白偶联及能量转移技术等方法，对GPCR进行生物学和化学检测已开始在CF系统中进行，有望实现高通量和自动化的配体筛选。
Table 3. 使用CF系统合成的功能性离子通道和转运蛋白
6.2从抗体发现到生产
CF技术可用于抗体的高通量筛选与展示，并可缩短抗体发现到生产的时间。尽管哺乳动物细胞培养系统被广泛应用，但CF技术可以提供更高效的高通量筛选方法，特别是在早期评估候选抗体时。
6.3疫苗开发
CF系统可用于合成疫苗抗原。CFPS技术的最新进展允许基于大肠杆菌CF裂解物创建冻干无细胞表达系统。使用CF方法合成抗原并同时将其掺入纳米脂蛋白是未来疫苗开发的一种很有前途的方法。
Table 4.利用无细胞系统合成的疫苗抗原
6.4抗菌化合物
使用大肠杆菌CF系统合成抗菌肽AMP，包括绞痛素和其他10种不同的AMP。AMPs被发展成为抗生素的替代品，并已在大肠杆菌抑制试验中验证了部分AMP的功能。
6.5蛋白质的定点标记
通过CFPS的开放性，可将非经典氨基酸（ncAAs）共翻译结合机制添加到标准反应组分中。常用方法包括预充电tRNA、琥珀抑制技术、生物正交点击反应和PEG部分修饰，还有其他策略。掌握这一技术可以为蛋白质添加新功能和精确的PTM，并已被用于合成高量PTMs的人MEK1激酶和位点特异性聚乙二醇化的人EPO。
七、展望和未来方向
CFPS技术有广泛的应用前景，但同时也面临着一些挑战和限制。如高质量蛋白质的合成、生产成本、可扩展性和安全性等问题，以实现其药物发现和评估的潜力。作为一种新兴的技术，无细胞蛋白质合成技术还有很多需要发展的方面。未来该技术的应用领域可能会进一步扩大，例如在生物药物制备、疫苗开发、基因编辑和代谢组学等领域。但同时，该技术也面临着成本高昂、产出低、反应时间长等挑战。
总结
CFPS技术是一种快速、简便和灵活的蛋白质表达技术，具有广泛的应用前景和重要的经济价值。在药物研发和生物学研究上，可以带来更高的效率、精度和多样性，同时也满足了实现精准医学和个性化医疗的需求。尽管该技术在发展过程中还面临着一些挑战和限制，但通过不断的探索和创新，CFPS技术将会成为未来药物研发的重要方向之一。
作者：杜静
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