无细胞蛋白表达——难度蛋白表达“急救包”
2025-01-06
大多数生物合成的焦点都集中于活细胞，但是细胞的运作系统和内部途径不免也造成障碍。主要因为细胞的生长、进化、优化及适应性过程，由于活细胞生命系统的复杂性，细胞生长的不可取消性，胞内噪声干扰，再加上细胞膜的阻碍，都大大限制了生物组件的改造。
另外，异源宿主细胞内的环境与天然环境有很大差别，这些不相似性或不匹配性导致如包涵体生成、蛋白质错误折叠、代谢负荷不平衡和对宿主细胞有毒性等。
面对细胞的复杂特征及问题，新的无细胞合成生物学正在兴起。相比于细胞体系蛋白表达，无细胞蛋白表达体系展现出独特优势。
CFPS案例展示——包涵体蛋白
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。无细胞蛋白表达，通过加入辅助蛋白折叠的分子伴侣等成分，可以将部分在大肠杆菌内成包涵体表达的蛋白，转变为上清可溶性表达。
IL-2是趋化因子家族的重要细胞因子，但是在原核表达中，IL-2常常以包涵体的形式表达。使用PLD无细胞表达、Brand A(Overseas)CHO细胞表达、Brand B(China)的原核表达分别对IL-2的上清表达情况和活性鉴定。
图A：IL-2在 PLD无细胞表达方式的上清可溶性表达，显示清晰条带。图B: 细胞活性测试，PLD无细胞表达方式生产的IL-2活性与Brand A(Overseas)CHO细胞表达的活性相当，也优于Brand B(China)的原核表达产品。
CFPS案例展示——二硫键蛋白
在蛋白质结构中，二硫键对于维持蛋白质的构象稳定性非常重要。例如，抗体分子中的重链和轻链通过二硫键相连，帮助保持抗体正确的构象以识别特定抗原。一旦二硫键发生错误折叠或失去这些键，可能会导致蛋白质失活或降解。无细胞系统寻求在相同空间同时完成蛋白质合成、折叠和二硫键形成。
某个含6对二硫键的蛋白，使用PLD无细胞表达的方式、和基于细胞表达的方式分别对其上清表达情况鉴定，同时PLD无细胞蛋白表达活性与某市售产品对比。
图A：蛋白结构，黄色区域为二硫键结构。
图B：该蛋白在PLD无细胞表达方式的上清可溶性表达，显示清晰条带。在细胞表达体系上清未检测到条带。
图C: PLD生产该蛋白与某市售产品活性相当。
CFPS案例展示——毒蛋白
限制性内切酶对细胞的重组表达提出了重大挑战，作为重组蛋白在异源表达宿主中过表达时，其切割DNA的特性严重抑制宿主正常的生长和重组蛋白的表达，而导致难以获得有生物活性的目的蛋白。
通过PLD无细胞快速表达技术，成功表达出BamHI限制性内切酶。在质粒中加入PLD无细胞蛋白表达的BamHI限制性内切酶，浓度分别为0、0.001、0.0015、0.015、0.15 ug/uL，37℃酶切1h，验证酶活性。
图A:BamHI限制性内切酶在PLD无细胞系统中表达得到，粗纯后鉴定显示条带。图B:2,3,4,5泳道对应的质粒被切成线性模版，说明PLD无细胞蛋白表达的BamHI限制性内切酶具有活性，最低浓度为 0.001 ug/uL即可显示酶切活性。
珀罗汀无细胞蛋白表达服务——难度蛋白表达
珀罗汀生物依托自主研发的无细胞蛋白表达平台，无需依赖活细胞，直接在体外合成蛋白。已成功实现对细胞内难表达蛋白质的高效快速合成，成为难表达蛋白的救星。珀罗汀CFPS蛋白表达成功率高于96%，可生产对细胞有毒的蛋白、包涵体蛋白、二硫键蛋白等等。
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