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当无细胞蛋白合成遇上自动化：高通量蛋白筛选正在发生什么变化？

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AI+无细胞助力合成生物学发展｜从合成到测试仅需24小时！

发布时间：

2023-12-28

前言

根据世界卫生组织的数据，抗微生物耐药性(AMR)是全球十大健康威胁之一。2018年11月发表于Guardian上的Antimicrobial Resistance campaign表示抗菌素耐药性(AMR)正在超越癌症，每年已有70万人死于耐药性感染(“超级细菌”)，预计到2050年将造成每年1000万人死亡。抗微生物药物耐药性可能使全球经济损失100万亿美元，并使2800万人陷入贫困。2022年发表在《柳叶刀》上的一项研究，认为2019年有近500万人死于耐药细菌感染。研究还显示，AMR目前是全球第三大死因，仅次于心脏病和中风，超过了艾滋病、乳腺癌和疟疾造成的死亡。

随着抗生素药物的普及，我们迫切需要找到新型抗菌化合物以及开发合成方法。抗菌肽(AMPs)被认为是有前景的抗菌化合物，与经典抗生素相比，有以下几点优势：

1.大多数AMPs直接作用于细胞膜

2.表现出相对较高的杀伤率，

3.对AMPs的耐药性是由相当非特异性的机制赋予的。

今天小编和大家分享一篇发表在Nature Communications期刊上的文章“Cell-free biosynthesis combined with deep learning accelerates de novo-development of antimicrobial peptides(无细胞生物合成与深度学习相结合加速抗菌肽的从头开发)”，旨在为大家介绍一种将合成生物学和人工智能(AI)结合起来用于快速、高通量、低成本生产抗菌肽的方法。

研究背景

到目前为止，已经鉴定了大约5000个AMP，其中大多数是天然来源的。然而，这5000个AMP只占自然界中的一小部分。此外，来自基因组和宏基因组的AMP挖掘受到有限的天然(尚未发现)AMP以及可用的生物计算和实验性AMP挖掘工具的阻碍。因此，我们发现新AMP的能力是有限的。由于随机生成的肽不太可能显示出抗菌性能，因此AMP无限开发的一种方式是使用深度学习模型，该模型越来越多地用于从头开始的蛋白质和肽设计。

本研究将深度学习和无细胞蛋白合成(CFPS)相结合，用于从头设计、在24小时内小规模快速生产和筛选AMP，每个AMP生产测定<10美元(不包括DNA片段的成本)。在探索了约500000个理论序列后，我们筛选了500个候选AMP，以鉴定30个与任何天然序列完全无关的功能性AMP。

研究结果

使用深度学习的AMP从头设计

对于AMP的从头设计，研究采用了先前研究中两个版本的深度可操作变分自动编码器(VAE)在其损失函数中是否有效。生成VAE是一种无监督的学习模型，它只接受AMP序列作为输入，并包括编码器、隐空间和解码器。研究人员首先使用UniProt中约150万个肽序列作为通用数据集预训练VAE。其次，使用约5000个已知AMP的数据集对预训练的VAE进行迁移学习，以设置用于从头生成AMP的隐空间。为了减少用于实验测试的AMP的数量，根据其预测的生物活性，即其最小抑制浓度(MIC)来选择潜在的候选者。为此，研究人员建立了预测性深度学习模型，用这些序列和约5000个已知AMP进行训练(序列MIC关系，图1b)。并使用了卷积神经网络(CNN)和递归神经网络(RNN)作为回归函数。回归函数根据其预测的MIC对这些从头开始的AMP进行优先排序。在第五轮中，使用不同版本的模型，通过从隐空间采集产生了约500000个新肽。我们根据长度和活性将这些肽筛选至约50000个候选肽，并优先选择500个AMP候选肽进行湿实验室生物活性测试(图1c)。

图1: 通过深度学习和无细胞生物合成从头开发AMPs的工作流程

无细胞生物合成能够快速筛选功能性AMPs

为了建立基于CFPS的AMPs筛选，研究人员设计了一个用于高通量合成和测试AMP 384孔的实验管道(图1d)。

该系统基于线性DNA模版，并将DNA模板(10nM)直接加入10μL无细胞转录(TX)-翻译(TL)系统，在4小时内产生AMPS。通过对体外产生的肽进行抗菌活性测试，鉴定出那些通过抑制生长而表现出抗菌活性的肽。总之，CFPS的整个过程以及随后的生物活性测试需要约24小时，因为该系统使用线性DNA，不需要任何广泛的克隆或肽纯化步骤。

功能性AMPs

研究人了员进行一系列验证，比如AlphaFold29预测、BLAST搜索等，结果表明从头AMP与其天然对应物具有相同的物理化学构建原理，但在氨基酸序列上与它们不同。接着，研究人员使用分子动力学(MD)模拟来研究我们的AMP与带负电的细菌内膜(IM)和人类质膜(PM)模型的相互作用。与人类质膜相比，所有的AMPs通常都以细菌膜为目标，然而，其偏好程度取决于个体AMP。研究人员进一步化学合成了功能性AMPs，并对其生物活性进行了表征，特别是最小抑菌浓度(MIC)，以及溶血(HC50)和细胞毒性(CC50)，两者均以50%的毒性浓度表示。结果表明，生物活性与毒性的关系对我们的几种新AMPs非常有利。研究人员决定继续使用16种表现出良好生物活性与毒性比的AMPs，并排除了6种因为MIC高和/或HC50/CC50低而出现的AMPs。此外，其在体外还展示出broad-band活性。

图2:从头生成和优先 AMP 的无细胞生产以及针对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的活性筛选

从头合成的AMP体外无耐药性

在体外研究中有 6 种从头设计的 AMPs 分子展示出了针对多重耐药病原体的强抗菌活性和极低的耐药性与人体细胞毒性。不仅包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属等多重耐药 ESKAPE 病原体，甚至对鼠疫耶尔森菌和炭疽杆菌也具有活性。

图3: 化学合成的功能性AMPs的生物活性表征

结论

本文深刻地证明了深度学习方法识别和/或开发新AMPs的力量。通过使用CFPS极大地推进了AMP开发中的设计-构建-测试周期。避免了可能受到可合成和测试的肽数量有限以及从设计到验证所需时间相对较长的影响。尽管在这项研究中，使用CFPS管道与天然氨基酸线性肽，但CFPS的一个独特优势是有可能合成含有循环和非经典氨基酸的肽，这在未来可以得到充分利用。

总的来说，该篇研究工作提供了一个原理证明，即如何在未来使用CFPS来充分利用机器学习方法的潜力。特别是在DNA合成成本不断下降的情况下，该研究将深度学习和CFPS相结合的方法为肽的生产和筛选提供了一种时间短、成本低和劳动力少的方法。因此，该项工作有可能以更高的速度和深度探索AMPs的设计功能空间。这将有助于未来更多地发现和开发肽基候选药物。

珀罗汀生物作为一家专业的无细胞蛋白表达生物技术公司，拥有国家高层次领军人才、海归博士等人才组成的专业技术团队，以自主研发、独具特色的无细胞蛋白表达技术平台为依托，专业从事多肽、重组蛋白、基因工程抗体、重组疫苗以及大分子蛋白药物的研究和开发，同时为广大生物医药企业和研究机构提供无细胞蛋白表达产品、蛋白原料试剂及定制化服务。