应用场景
驱动多学科研究与产业突破的核心蛋白解决方案
核糖体展示——体外蛋白/抗体筛选的无细胞利器
发布时间：
2026-10-26
做抗体和治疗性蛋白开发的同行，想必对文库筛选的技术瓶颈深有体会：想撬动超大规模文库的潜力，往往被宿主转化的效率牢牢卡住上限。而核糖体展示作为完全体外无细胞的蛋白/抗体文库筛选技术，刚好跳出了这个传统框架：通过移除终止密码子、在 mRNA 两端引入茎环结构，让翻译出的蛋白和自身 mRNA 通过核糖体绑定在一起，形成稳定的 PRM 三元复合物（蛋白-核糖体-mRNA）。
这些年，这项技术把无细胞蛋白质合成与体外分子筛选深度结合，已经成为纳米抗体、scFv 以及各类治疗性蛋白发现和优化的核心工具之一。
这项技术的发展脉络
1994 年，Mattheakis 等人发表多聚核糖体展示研究，首次用 E. coli S30 无细胞体系从 10¹² 规模的随机肽文库中筛选配体。1997 年，Hanes 和 Plückthun 在 PNAS 发表的文章正式将核糖体展示落地到体外蛋白质选择与定向进化：scFv 经 5 轮“转录-翻译-抗原亲和筛选-PCR”循环富集 10⁸ 倍，还在体外进化中自发获得了新的有益突变。
与噬菌体展示这类依赖宿主细胞的传统技术不同，核糖体展示不需要通过细胞转化来维持每一个候选克隆，文库容量可轻松达到 10¹²–10¹⁴ 量级，比噬菌体展示高出 3–5 个数量级。再加上近年无细胞蛋白质合成体系、测序技术和自动化平台的快速迭代，核糖体展示已经在抗体发现、亲和力成熟和蛋白质工程领域得到广泛应用。
经典核糖体展示的完整操作流程
一套标准的核糖体展示实验通常分为 5 个核心步骤：
1. 文库构建与模板设计
根据目标分子搭建 VHH、scFv 或其他类型的蛋白质文库。模板设计需提前考虑 T7 启动子、核糖体结合位点（RBS）、编码序列、C 端间隔序列（spacer）等要素。核糖体展示的特殊之处在于：特意移除终止密码子，并在 mRNA 的 5′ 和 3′ 端引入茎环结构——5′ 茎环保护 mRNA 免遭降解，3′ 茎环配合“无终止密码子”设计使核糖体在 mRNA 末端停滞，三者共同保证肽链、核糖体和 mRNA 形成稳定的三联复合物。
2. 体外转录与翻译
随着无细胞表达系统的不断优化，核糖体展示的整体效率大幅提升。目前常用体系分两类：细胞提取液系统（如 E. coli S30），以及通过纯化组分搭建的 PURE 类重构体系。
3. 靶标结合与洗涤
将展示文库与目标抗原共同孵育，再用适配的洗涤条件去除未结合或结合力弱的复合物。这个环节直接决定筛选结果：靶标固定方式、抗原活性、非特异性吸附、洗涤强度和复合物稳定性，每个变量都会影响富集序列的质量。
4. 回收 mRNA 与扩增
经典做法是用 EDTA 螯合镁离子（或冷休克）解离核糖体，从保留的复合物中回收 mRNA，经反转录和 PCR 扩增，得到下一轮筛选的模板，完成循环衔接。
5. 多轮筛选与测序分析
通过多轮梯度筛选富集特异性结合分子，搭配 NGS 测序分析序列，筛出值得后续验证的候选抗体。更激进的路线是把核糖体展示直接做到测序芯片上——Holliger 组 2024 年发表的 deep screening 技术，在 Illumina flow cell 上原位完成 DNA 成簇、mRNA 转录翻译和亲和力筛选，3 天内即可从未经预富集的合成 scFv 文库中直接筛出高皮摩尔级先导分子，并配合机器学习完成亲和力成熟。
做好核糖体展示不能忽略的 5 个核心关键点
关键点一：展示复合物的稳定性
PRM 三元复合物是非共价结合，温度、镁离子浓度、反应时间和洗涤条件都可能破坏其完整性。翻译温度常需适当下调，反应体系中一般要补 RNase 抑制剂。复合物大量丢失轻则造成回收不足，重则直接引入筛选偏差。
关键点二：无细胞体系与展示流程的兼容性
普通表达体系追求高产，但核糖体展示还要求体系能长期维持核糖体-mRNA 的稳定结合。常见的坑就是直接选表达量最高的体系，结果完全不适合展示。
关键点三：抗原质量与背景控制
抗原的固定方式和有效活性直接左右筛选结果；不控制非特异性吸附，很容易拿到大量假阳性。实验必须设置阴性对照和无关抗原对照，所有候选分子都要独立验证。
关键点四：筛选压力与多样性的平衡
压力太弱，背景序列持续富集；压力太强，又会丢失真实候选。设计策略时必须同时兼顾目标结合、文库多样性和复合物稳定性三个维度。
关键点五：富集程度不等于亲和力
NGS 显示的富集程度受表达效率、折叠效果、展示效率、回收率和扩增偏差等多重因素干扰，不能直接等同于 K_D。候选分子必须用 BLI、SPR 测定真实结合动力学，并完成独立功能验证。
成熟的无细胞体系
PURE是一类通过纯化组分重构的无细胞蛋白质合成体系，2001年Shimizu等人在Nature Biotechnology发表的经典研究，为整个技术路线打下了核心基础。珀罗汀生物（PLD Technology ）依托无细胞体系研发的无细胞蛋白表达试剂盒可用于体外蛋白质合成和展示技术开发。
目前核糖体展示的主流应用场景
VHH 与 scFv 发现：从 10¹²–10¹⁴ 量级候选文库中高效筛选抗原结合分子
抗体亲和力成熟：在已有分子基础上构建变异文库，筛出结合活性更强的候选
蛋白质工程：定向优化酶及其他功能蛋白的稳定性、活性等特性
高通量筛选与 NGS 联用：识别富集序列，快速排序候选分子
AI 设计闭环：AI 生成候选序列 → 实验筛选 → 真实数据反哺下一轮设计，大幅缩短研发周期
结语：
无细胞表达、NGS 和 AI 蛋白质设计的发展越来越快，核糖体展示完全有潜力成为未来抗体和治疗性蛋白发现平台的核心组成部分。但说到底，真正决定研发效率的，永远是展示体系的稳定性、筛选数据的可靠性，以及候选分子经独立实验验证后的真实功能。
参考资料
1.Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ. PNAS. 1994;91(19):9022–9026. DOI: 10.1073/pnas.91.19.9022.
2.Hanes J, Plückthun A. PNAS. 1997;94(10):4937–4942. DOI: 10.1073/pnas.94.10.4937.
3.Shimizu Y, et al. Nature Biotechnology. 2001;19:751–755. DOI: 10.1038/90802.
4.Porebski BT, et al. Nature Biomedical Engineering. 2024;8(3):214–232. DOI: 10.1038/s41551-023-01093-3.
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